Identifizierung von Effektoren der Pheromon-MAPK-Kaskade in Ustilago maydis

Die sexuelle Entwicklung von Ustilago maydis, dem Erreger des Maisbeulenbrandes, wird durch die Fusion zweier haploider Sporidien eingeleitet. Das aus der Zellfusion hervorgehende Dikaryon ist dann in der Lage die Maispflanze zu infizieren. Diese Entwicklungsprozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der biallelische a-Locus kodiert für ein Pheromon-Pheromonrezeptorsystem, das die Zell-Zellerkennung und die anschließende Zellfusion gewährleistet. Der multiallelische b-Locus kodiert für zwei Homeodomänenproteine, bE und bW, die nur in bestimmten Kombinationen heterodimerisieren und weitere Entwicklungsschritte ermöglichen. Während der Zell-Zellerkennung induziert das Pheromonsignal die Ausbildung von Konjugationshyphen und die Transkription der a- und b-Paarungstypgene. Die Induktion der a- und b-Gene erfolgt über den Transkriptionsfaktor Prf1, der über den cAMP-Signalweg und das Pheromon-MAPK-Modul posttranskriptionell aktiviert wird. Das aktive MAPK-Modul induziert zusätzlich die Transkription von prf1 und ist außerdem für die Ausbildung der Konjugationshyphen verantwortlich. Prf1 wird für die Konjugationshyphenbildung jedoch nicht benötigt. Diese Ergebnisse früherer Arbeiten deuteten auf die Existenz von weiteren unterhalb des MAPK-Moduls agierenden Regulatoren der Pheromonantwort hin. In dieser Arbeit wurden mit Rop1 und Hmg3 zwei HMG-Domänen-Transkriptionsfaktoren identifiziert, die wie Prf1 zur sequenzspezifisch DNA-bindenden Klasse dieser Proteinfamilie gehören. Während hmg3-Deletionsmutanten zwar einen schwachen Zellfusions- und Pathogenitätsdefekt zeigten, jedoch nach Pheromonstimulation Konjugationshyphen bildeten und lediglich eine leicht reduzierte Expression des Pheromongens aufwiesen, führte die Deletion von rop1 zum Verlust der Pheromon-induzierten Genexpression sowie der Konjugationshyphenbildung. Weitere Untersuchungen zeigten, dass rop1 selbst in Stämmen, die eine konstitutiv aktive Variante der MAPKK Fuz7 exprimieren für die Transkription von prf1 sowie die a- und b-Genexpression erforderlich ist. Dieser Ansatz ergab auch, dass rop1 an der Ausbildung von Konjugationshyphen nur indirekt beteiligt ist. Desweiteren wurden die starken Zellfusions- und Filamentationsdefekte von Drop1-Stämmen durch die konstitutive Expression von prf1 komplementiert, was darauf hindeutete, dass Rop1 einen entscheidenden Regulator der prf1-Expression darstellt. Gelretardationsexperimente ergaben dann, dass Rop1 in vitro spezifisch an den prf1-Promotor bindet und ermöglichten ferner die Identifizierung eines DNA-Bindemotivs, das sich in einer Reihe weiterer putativer Promotorregionen des U. maydis Genoms findet. In Northern-Analysen konnte gezeigt werden, dass das genetisch aktivierte MAPK-Modul die rop1-Expression über die MAPK Kpp2 induziert. Im Gegensatz dazu führte die genetische Aktivierung des cAMP-Signalweges zur Repression der rop1-Expression. Überraschenderweise exprimierten rop1-Deletionsmutanten auf der Pflanzenoberfläche ausreichend prf1, um alle Entwicklungsstadien zu durchlaufen und volle Pathogenität zu entwickeln. Dies deutet auf die Existenz von zusätzlichen Regulatoren der prf1-Expression auf der Pflanze hin

Pathogenitätsrelevante Signalkaskaden in Ustilago maydis: Identifikation von Zielgenen

In Ustilago maydis sind drei Signalwege bekannt, die für die pathogene Entwicklung dieses Brandpilzes essentiell sind. Während die Kpp4/Fuz7/Kpp2-MAPK-Kaskade und der cAMP-Weg für den Paarungsprozess und die Ausbildung von frühen Infektionsstrukturen benötigt werden, ist die Kpp6-MAPK-Kaskade entscheidend für die Penetration der Blattoberfläche. Bisher waren nur wenige Zielgene dieser Signalwege bekannt. In dieser Arbeit wurden isogene Stämme konstruiert, die eine regulierbare genetische Aktivierung der einzelnen Signalkaskaden ermöglichen. Durch genomweite Microarray-Analysen (Affymetrix)wurde das Transkriptom dieser Stämme untersucht und mit der Situation nach Pheromonstimulation verglichen. Unter den differentiell regulierten Genen konnten neben zahlreichen bekannten auch eine Vielzahl neuer Zielgene identifiziert werden. Vergleichende Analysen der Transkriptome zeigen, dass eine deutliche Überlappung der Signalwege vorliegt. An der Regulation dieses Netzwerks sind neben dem HMG-Domänen Transkriptionsfaktor Prf1 weitere Komponenten beteiligt, die vermutlich posttranskriptionell reguliert werden. Nach Aktivierung des cAMP-Wegs wurden drei koregulierte Gencluster identifiziert, die eine potentielle Funktion bei der Eisenaufnahme haben. Unter den koregulierten Genen befinden sich Vertreter des reduktiven und des nicht-reduktiven Eisenaufnahme-systems, u.a. die bereits bekannten Gene sid1 und sid2, die für eine Ornithin-5-Monooxigenase und eine Ferrichrom-Siderophoren-Peptidsynthetase kodieren. Für die Expression dieser Gene wird ein intakter cAMP-Weg benötigt, darüber hinaus werden die Gene durch Eisen reprimiert. Da bereits bekannt war, dass das nicht-reduktive Eisenaufnahmesystem keine Rolle bei der pathogenen Entwicklung von U. maydis spielt, konzentrierte sich die Arbeit auf die hochaffine Eisenpermease die Teil des reduktiven Eisenaufnahmesystems ist. Durch Komplementation einer Hefemutante konnte gezeigt werden, dass fer2 für eine funktionelle Eisenpermease kodiert. fer2-Deletionsmutanten zeigen einen Wachstumsdefekt auf Eisenmangelmedium. In der Pflanze ist die Proliferation solcher Mutanten stark reduziert und die Ausbildung von Pathogenitätssymptomen deutlich abgeschwächt. Dies zeigt, dass Komponenten des reduktiven Eisenaufnahmesystems Virulenzfaktoren in U. maydis sind

Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen bei der pathogenen Entwicklung von Ustilago maydis

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Eine erfolgreiche Infektion der Maispflanze durch den phytopathogenen Basidiomyzeten ist abhängig von zahlreichen morphologischen Transitionen, wie beispielsweise die pheromoninduzierte Bildung von Konjugationshyphen, der Wechsel zum dikaryotischen Wachstum nach der Fusion zweier kompatibler Sporidien und das verzweigte Wachstum des Myzels nach dem Eindringen des Pilzes in die Wirtspflanze. Unter Verwendung einer bioinformatischen Analyse konnten im Vorfeld dieser Arbeit bereits 24 offene Leserahmen (ORF) identifiziert werden, die für potenziell RNA-bindende Proteine kodieren und den Ausgangspunkt dieser Arbeit darstellten. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von 3 PUM-, 4 KHD- und 11 RRM-Proteinen auf die Entwicklungsprogramme über einen revers-genetischen Ansatz untersucht. Durch eine extensive phänotypische Analyse konnte für die Genprodukte dreier ORFs ein Einfluss auf die Entwicklung von U. maydis festgestellt werden; die Proteine wurden mit Khd1, Khd4 bzw. Rrm4 bezeichnet. Während die Deletion von khd1 zu einem kältesensitiven Verhalten führt, hat die Deletion von khd4 Veränderungen der Sporidienmorphologie, Wachstumsrate, Pheromonantwort sowie der Pathogenität zur Folge. Die Deletion von rrm4 führt zu einem Verlust des schnellen polaren Wachstums und zu einer reduzierten Virulenz. Die Domänenarchitektur von Rrm4 zeigt Ähnlichkeiten mit Proteinen der ELAV-Familie (embryonic lethal and abnormal vision). Neben den drei für ELAV-Proteine typischen Modulen der RRM-Domäne im N-Terminus, besitzt Rrm4 eine zusätzliche C-terminale PABC-Domäne (poly[A]-binding protein C-terminal domain), die als Proteininteraktionsdomäne bekannt ist. Rrm4 akkumuliert PABC-abhängig in zytoplasmatischen Partikeln, die sich bidirektional entlang des Mikrotubulizytoskeletts bewegen. Bei der Untersuchung des Transportmechanismus konnte eine indirekte Beteiligung des konventionellen Kinesins Kin2 gezeigt werden, weshalb die Beteiligung eines weiteren Motorproteins am plusendgerichteten und des Dyneins am minusendgerichteten Partikeltransport vermutet wird. Darüber hinaus lassen Mutationsstudien an den RRM-Domänen eine Beteiligung der ersten beiden RRM-Domänen an der RNA-Bindung vermuten. Die Bedeutung von Rrm4 auf die Pathogenität von U. maydis und die Bewegung des RNA-bindenden Proteins entlang des Mikrotubulizytoskeletts deuten auf eine wichtige Funktion von RNA-Transport während der pathogenen Entwicklung von U. maydis hin

Creating novel specificities in a fungal nonself recognition system by single step homologous recombination events

In many organisms, two component systems have evolved to discriminate self from nonself. While the molecular function of the two components has been elucidated in several systems, the evolutionary events leading to the large number of different specificities for self–nonself recognition found in most systems remain obscure. We have investigated the variation within a multiallelic nonself recognition system in the phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis by means of sequence analysis and functional studies. The multiallelic b mating type locus of U. maydis ensures outbreeding during sexual development. Nonself recognition is specified by the two homeodomain proteins, bE and bW, encoded by the b locus. While bE–bW combinations from the same allele do not dimerize, bE and bW proteins originating from different alleles form a heterodimeric complex that functions as master regulator for sexual and pathogenic development. We show that novel specificities of the b mating type locus have arisen by single homologous recombination events between distinct b alleles that lead to a simultaneous exchange of subdomains involved in dimerization in both bE and bW, altering the specificity of both proteins in a single step

Multiallelic recognition: Nonself-dependent dimerization of the bE and bW homeodomain proteins in ustilago maydis

AbstractIn the plant pathogenic fungus Ustilago maydis, sexual and pathogenic development are controlled by the multiallelic b mating-type locus. The b locus encodes a pair of unrelated homeodomain proteins termed bE and bW, with allelic differences clustering in the N-terminal domains of both polypeptides. Only combinations of bE and bW of different allelic origin are active. We have investigated the underlying molecular mechanism for this intracellular self/nonself recognition phenomenon. By using the two-hybrid system, we were able to show that bE and bW dimerize only if they are derived from different alleles. Dimerization involves the N-terminal variable domains. Different point mutants of bE2 were isolated that function in combination with bW2. The majority of such bE2 mutant polypeptides were also able to form heterodimers with bW2 in the two-hybrid system. Nonself-dependent dimerization of bE and bW was supported with a biochemical interaction assay with immobilized proteins. Our results suggest a model for self/nonself recognition in which variable cohesive contacts direct dimerization

A two-component regulatory system for self/non-self recognition in Ustilago maydis

AbstractIn U. maydis the multiallelic b locus controls sexual and pathogenic development. In the b locus a gene coding for a regulatory protein had been identified, and it was suggested that the interaction of two b polypeptides specified by different alleles programs sexual development in this fungus. We now demonstrate the existence of a second regulatory gene in the b locus. We term this gene bW and refer to the former as the bE gene. Both genes exist in many alleles. Although unrelated in primary sequence, both genes are similar in their overall organization. The gene products display allele-specific variability in their N-terminal domains, show a high degree of sequence conservation in the C-terminal domains, and contain a homeodomain-related motif. Genetic evidence is provided to show that the pair of bE and bW polypeptides encoded by different b alleles is the key regulatory species

The b alleles of U. maydis, whose combinations program pathogenic development, code for polypeptides containing a homeodomain-related motif

AbstractU. maydis is a fungal pathogen of corn with two forms: one is yeast-like and nonpathogenic; the other is filamentous and pathogenic. The b locus, with 25 different alleles, regulates this dimorphism: any combination of two different alleles triggers pathogenic development, whereas the presence of identical alleles results in the yeast-like form. We have cloned four b alleles (b1, b2, b3, and b4) and show that the b locus contains a single open reading frame (ORF) of 410 amino acids with a variable N-terminal region and a highly conserved C-terminal region (60% and 93% identity, respectively). Mutational analysis confirms that this ORF is responsible for b activity. The b polypeptides appear to be DNA binding proteins because they contain a motif related to the homeodomain in their constant region. We propose that combinatorial interactions between b polypeptides generate regulatory proteins that determine the developmental program of the fungus

The power of discussion : Support for women at the fungal Gordon Research Conference

We would like to thank Abigail LaBella for sharing the pictures taking during the session and Felicia Wu for her suggestions. We are grateful to all the colleagues that helped leading the discussion groups and all the participants of the session.Peer reviewedPostprin

Fungal model systems and the elucidation of pathogenicity determinants

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